E.3. TÉCNICAS DE INGENIERÍA GENÉTICA Y SUS APLICACIONES (III): TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE Y OTRAS

 1. HIBRIDACIÓN DEL ADN

Objetivo: localizar el ADN o la colonia que porta el ADN que interesa, p.ej. el gen de la insulina, en el conjunto del ADN celular, para su posterior aislamiento, clonación o manipulación.

2. SECUENCIACIÓN DEL ADN

 Método de Sanger: 

El inglés Frederick Sanger (uno de los dos únicos científicos que ha conseguido el Nobel dos veces en la misma especialidad, en su caso de Química, en 1958 por obtener la primera secuencia de una proteína, la insulina y otro en 1980 por desarrollar el método Sanger de secuenciación de ADN, que fue de importancia crucial en el PGH) desarrolló un método de secuenciación del ADN basado en didesoxinucleótidos fluorescentes de diferente color (nucleótidos sin el OH-3´).

Este método, comercializado inicialmente por la empresa biotecnológica Applied Systems, fue creado en 1977 y ampliamente utilizado por 40 años. Sin embargo, actualmente está siendo sustituido por los métodos de secuenciación Next-Gen, es decir, de la siguiente generación o de alto rendimiento.

CLONACIÓN MOLECULAR: inserción de un ADN exógeno en un ADN de un organismo hospedador, como una bacteria, para que éste exprese el gen exógeno y fabrique proteínas de otra especie.

ETAPAS:

1. Elección del vector adecuado, dependiendo del tipo de organismo en el que se pretenda introducir el gen y del tamaño del mismo. P.ej. un plásmido modificado de E. coli.

Debe contener un marcador de selección, como el gen de resistencia a la Ampicilina, un gen indicador con una secuencia diana dentro, como el gen de la galactosidasa, que produce coloración azul en presencia de galactosa, de modo que al introducir el gen exógeno en él, queda interrumpido, y produce colonias blancas.

2. Elección y aislamiento del fragmento de ADN exógeno: se rompen las células y los núcleos mediante lisis p.ej. por choque osmótico y se obtiene el ADN humano o de otra procedencia. Se corta con la misma endonucleasa de restricción que el vector, p.ej. con EcoRI.

3. Amplificación de la cantidad de ADN mediante la PCR.

4. Creación del ADN recombinante, mezclando los fragmentos de ADN humanos y los plásmidos cortados por la misma endonucleasa de restricción y con una ADN Ligasa. Solo algunos plásmidos recombinantes llevan el gen de interés (p.ej. de la insulina).

5. Inserción del plásmido en el hospedador, que sufre una transformación bacteriana (uno de los 3 mecanismos parasexuales). Solo algunas bacterias se transforman (incorporan ADN exógeno) y de éstas solo algunas incorporan el plásmido recombinante con el gen de la insulina.

6. Cultivo de las células recombinantes. 

    Le echamos Ampicilina, con lo que eliminamos las bacterias que no se han transformado.   

    Las bacterias que han incorporado plásmidos no recombinantes, dan colonias azules. No interesan.

    Las bacterias que han incorporado plásmidos recombinantes, dan colonias blancas. De éstas, solo interesan las que llevan plásmidos recombinantes con el gen de la insulina.

7. Selección de la colonia o clon que interesa (la que lleva el gen de la insulina). Se localizan mediante la técnica de hibridación en colonias, puestas de manifiesto mediante una radiografía.

8. Producción de la proteína recombinante (insulina) en grandes cantidades, pasando del laboratorio a fermentadores industriales o biorreactores.