EL "BOOM" DE LA INGENIERÍA GENÉTICA Y SUS IMPLICACIONES ÉTICAS

La Ingeniería Genética o Manipulación del ADN y sus aplicaciones biotecnológicas presentan numerosos puntos conflictivos, ya que la Biotecnología forma parte de un entramado socioeconómico y político que hace que esté en el punto de mira de filósofos (Bioética), de la Iglesia Católica, de los ecologistas o de los movimientos sociales anti-globalización.

En la expansión de las biotecnologías han confluido los siguientes elementos:
1. La nueva tecnología del ADN recombinante (la ciencia genética se hace ingeniería). A partir de los años 70.
2. La secuenciación del genoma humano y otros genomas. El PGH culminó en el año 2000, con la publicación del primer borrador por parte del Consorcio Público del PGH y de la compañía Celera Genomics.
3.  La concesión de patentes sobre genes, líneas celulares y organismos transgénicos, como incentivo para las compañías biotecnológicas, aliadas a la industria farmaceútica o de fabricación de pesticidas. En 1980 la Corte Suprema de EE UU concedió la 1ª patente a un organismo GM: una bacteria Pseudomonas modificada para metabolizar petróleo y ser usada para eliminar derrames, creada por General Electric. Más tarde determinó que cualquier organismo pluricelular GM podía ser patentado. Así comenzó el proceso de privatización de los genes (secuencias de ADN u organismos GM propiedad de las compañías biotecnológicas).
4. La globalización del comercio y de la industria. Se puede decir que comienza cen 1995 con la creación de la OMC (Organización Mundial de Comercio). A partir de ese momento se extienden los tratados de libre comercio y la desregulación del comercio internacional que favorece a las compañías multinacionales (resultado de la fusión de compañías de diferentes países o que operan en otros países pero las ganancias retornan al país de origen).
5. La nueva sociobiología, con su énfasis en la base genética de la conducta humana. La sociobiología nació en 1975 con el libro del biólogo estadounidense Edward O. Wilson: Sociobiology: the new synthesis.
6. La revolución informática, Internet (la www nació en 1990) y su aplicación a la biología: la Bioinformática. Su origen se puede situar en 1970 con la publicación de un algoritmo para alineamiento de secuencias. 

 
Los modelos Lego y Ecosistema: dos culturas epistémicas de entender el genoma

EL CÁNCER, ¿HEREDITARIO O AMBIENTAL? REPLICATIVO

La mayor parte de casos de cáncer no se deben ni a una mala herencia ni a hábitos poco saludables, sino sencillamente a la mala suerte durante el proceso de replicación, es decir, a mutaciones aleatorias provocadas por la ADNpol, que no es perfecta, en proto-oncogenes o en genes supresores de tumores. A pesar d esu capacidad de corregir sus propios errores, hay algunos errores que se le pasan por alto, y surgen mutaciones:

APLICACIONES V: OBTENCIÓN DE ORGANISMOS TRANSGÉNICOS. 2ª parte: PLANTAS

1. TABACO (Nicotiana tabacum)
La primera planta transgénica se creó hace 35 años,  en 1982. Era resistente a un antibiótico. En 1986 se hicieron las primeras pruebas de campo con plantas transgénicas de tabaco resistentes a herbicidas. En 1987 se creó una planta de tabaco resistente a insectos por producir un insecticida natural procedente de una bacteria. En 1992 se aprobó por 1ª vez la comercialización de una planta transgénica: China aprobó una planta de tabaco resistente a ciertos virus. En 1994 la UE autorizó la comercialización de una planta de tabaco resistente a herbicidas.


2. SOJA (Glycina max)
La soja transgénica constituye el 50% de los cultivos transgénicos en la actualidad. En 1994 la primera soja transgénica, creada por el gigante de los cultivos transgénicos, Monsanto, fue introducida en el mercado estadounidense. Esta compañía produce un herbicida, Roundup, que contiene glifosfato, que podría ser cancerígeno a altas dosis, de modo que Monsanto vende a los agricultores el herbicida y la soja resistente al herbicida. Como esta soja es resistente al herbicida, los agricultores pueden emplear grandes cantidades. Tras expirar la patente de Monsanto de la primera variedad de soja resistente a Roundup, la Universidad de Arkansas creó una soja transgénica "genérica" (sin marca) por la mitad de precio de la que, además, se podían guardar las semillas de un año para otro (al contrario que la de Monsanto, que obligaba  a los agricultores a comprarle las semillas transgénicas todos los años o pagarle unas tasas).

3. MAÍZ (Zea mays)
El maíz transgénico constituye el 30% de los cultivos transgénicos. Monsanto también comercializa maíz transgénico resistente a Roundup y el maíz Bt, resistente a insecticidas.

4. ALGODÓN (Gossipium sp)
El algodón transgénico constituye el 14% de los cultivos transgénicos. Hay un tipo que incorpora el insecticida natural Bt, de un gen procedente de Bacillus thurigensis. También Monsanto comercializa algodón resistente a su herbicida.

5. CANOLA (VARIEDAD DE COLZA, Brassica sp)
La canola transgénica, para producir un tipo de aceite, constituye el 5% de los cultivos transgénicos. De nuevo Monsanto comercializa canola resistente a  Roundup.


6. ARROZ DORADO  (Oryza sativa)

Es el único caso de planta transgénica para cultivar en el que sus creadores renunciaron a la patente por motivos humanitarios. Este arroz produce beta-caroteno, precursor de la vitamina A, cuya deficiencia es endémica en partes de la India y de otros países que se alimentan en gran medida de arroz, produciendo gran cantidad de ceguera infantil.

 
Por oponerse a los transgénicos, incluido el arroz dorado, 109 Premios Nobel acusan a Greenpeace de crímenes contra la humanidad.

Recursos educativos en biotecnología vegetal del ITQB de Oeiras

  

APLICACIONES V: OBTENCIÓN DE ORGANISMOS TRANSGÉNICOS: 1ª Parte (Animales)

Los organismos trangénicos son aquellos que incorporan un transgen (gen foráneo procedente de otra especie). En este sentido las bacterias recombinantes son transgénicos, aunque se suele reservar el término transgénico a los organismos eucariotas que han sufrido la incorporación de un gen de otra especie, es decir, serían un tipo de OGM (Organismo Genéticamente Modificado).  Otros tipos de OGM son los cisgénicos, que incorporan un gen de la misma especie. Un OGM también podría ser un organismo que sin portar un gen foráneo, haya sido objeto de edición génica  através de la técnica CRISPR. Una de las principales aplicaciones es el cultivo de plantas transgénicas, con la que se obtienen alimentos transgénicos, sobre los cuales existe un intenso debate social.

Vídeo "Qué son los animales transgénicos". 3 minutos.


1. ANIMALES TRANSGÉNICOS
   1.1. Sapo de uñas africano (Xenopus laevis) 
Organismo modelo tetraploide. Estos anuros GM son usados en investigación y como bioindicadores de la contaminación.


   1.2. Mosca del vinagre (Drosophila melanogaster)

El Centro de Biología Molecular Severo Ochoa tiene un Servicio de Transgénesis de Drosophila, destinado  a proporcionar moscas del vinagre transgénicas para investigación a otros laboratorios.

1.3. Ratón (Mus musculus)

El primer animal transgénico, obtenido hace más de 20 años, fue un ratón gigante al que se había introducido el gen de la GH humano:



Ratones transgénicos que expresan una proteína verde fluorescente procedente de una medusa (el gen de esta misma proteína se trató de clonar en un macaco Rhesus, pero no se expresó suficientemente como para visualizarse, de modo que ANDi, inserted DNA leído al revés, fue un fiasco científico, además de abrir el debate de la Ingeniería Genética en Primates y Humanos) . Los ratones transgénicos son muy utilizados  como modelo para el estudio de enfermedades humanas.

   1.4. Ovejas, cabras y vacas.

En el Instituto Roslin de Edimburgo, donde crearon a la oveja Dolly (1º mamífero clonado), obtuvieron la 1ª oveja transgénica y clónica, la oveja Polly que expresaba el factores de coagulación IX, del que carecen los enfermos de hemofilia B. Murió con un año de edad.  En estos casos, se utiliza, la oveja, o la cabra o la vaca, como biorreactor, al producir leche con la proteína de interés. Una cabra transgénica produce un anticoagulante para prevenir la formación de coágulos en recién nacidos.
Una vaca transgénica, Patagonia I, produce insulina en la leche.
Otra vaca argentina, Rosita, era un OGM, con el objetivo de producir leche muy parecida a la humana, destinada a madres que no pueden amamantar a sus hijos.
Se ha obtenido una cabra transgénica que produce la seda de las telarañas en la leche.

   1.5. Peces fluorescentes para acuario: peces cebra Glofish



   1.5 Cerdos transgénicos

Se han creado para la obtención de  órganos histocompatibles para usarlos en xenotrasplantes.
   
  1.6. Mosquitos tigre (Aedes aegypyi)

Se han creado mosquitos con un gen incorporado letal para tratar de reducir las poblaciones de este mosquito en Brasil o en Florida, ya que transmite la fiebre amarilla, el dengue y el Zica, entre otras enfermedades.

Orugas como biorreactores usando baculovirus manipulados genéticamente  por Algenex, pequeña empresa biotecnológica de Pozuelo de Alarcón (Madrid)

UNIDAD 13: INGENIERÍA GENÉTICA

11 de abril: (estándar 8.1)
    1. Endonucleasas de restricción
    2. Vectores de clonación
    3. Técnicas de manipulación del ADN
    4. Clonación molecular
  
12 de abril: Aplicaciones de la Ingeniería Genética
   1. Construcción de genotecas
   2. Obtención de proteínas recombinantes (Estándar: valora la importancia de la biotecnología y la ingeniería genética en la obtención de productos farmaceúticos y en medicina).
   3. Obtención de microorganismos mejorados (Estándar: valora la importancia de la biotecnología y la ingeniería genética en la biorremediación).
   4. Huella genética
13 de abril:
   5. Obtención de animales transgénicos
   6. Obtención de plantas transgénicas
   7. Diagnóstico genético.
   8. Terapia génica.

16 de abril: (estándar 8.2)
   1. El PGH y el genoma humano.
   2. Implicaciones sociales y éticas del genoma humano y la ingeniería genética

CONTENIDOS	CRITERIOS DE EVALUACIÓN	ESTÁNDARES DE APRENDIZAJE
B3 ·        La ingeniería genética. Principales líneas actuales de investigación. ·        Organismos modificados genéticamente. ·        Proyecto genoma: Repercusiones sociales y valoraciones éticas de la manipulación genética y de las nuevas terapias génicas.	8. Desarrollar los avances más recientes en el ámbito de la ingeniería genética, así como sus aplicaciones.	8.1. Resume sobre las técnicas desarrolladas en los procesos de manipulación genética para la obtención de organismos transgénicos.
	9. Analizar los progresos en el conocimiento del genoma humano y su influencia en los nuevos tratamientos.	9.1. Reconoce los descubrimientos más recientes sobre el genoma humano y sus aplicaciones en ingeniería genética valorando sus implicaciones éticas y sociales.

APLICACIONES IV: HUELLA GENÉTICA

La Huella genética (DNA profiling) desarrollada por Alec Jeffreys en 1984, tiene numerosas aplicaciones en Genética Forense, como son los estudios de filiación o paternidad, o de parentesco en general, así como en Criminología., así como en Biología Evolutiva. Podemos enumerar las siguientes aplicaciones:
1. Condena o exoneración de un sospechoso de violación o asesinato.
2. Determinación de la identidad de un cadáver o de sus restos (p.ej. así se determinó que los restos de Colón, que República Domicana reclamaba poseerlos, están en la Catedral de Sevilla, por comparación con el ADNmt de su hermano, también enterrado en Sevilla).
3. Estudios de compatibilidad en donaciones de órganos.
4. Estudios filogenéticos y de las migraciones humanas en la prehistoria y en la historia.

APLICACIONES III: OBTENCIÓN DE MICROORGANISMOS "MEJORADOS"

Las técnicas del ADN recombinante permiten obtener o "mejorar" microorganismos capaces de:
1. Fabricar polímeros biodegradables o bioplásticos, como los PHA PoliHidroxiAlcanoatos.
2. Degradar hidrocarburos para eliminación de mareas negras y otros vertidos de petróleo: El petróleo es una fuente de carbono, es un nutriente. Lo que para los animales es tóxico, para las bacterias es una fuente de nutrientes. Éstas tienen una capacidad metabólica enorme, mucho mayor que la nuestra; esa es la clave de la Biorremediación.
3. Producir biocombustibles: científicos ingleses han creado una cepa de E. coli capaz de producir biodiesel. Aun no es competitivo frente al gasoil o al biodiesel procedente de aceites vegetales.
4. Producir vitaminas. Para producir vitamina C (ácido L-ascórbico) se ha modificado una bacteria con el gen de otra especie bacteriana, de modo que la mayor parte de esta vitamina producida en el mundo tiene un origen transgénico: Producción transgénica de ácido ascórbico.
5. Eliminación de metales pesados, en otro ejemplo de biorremediación:

APLICACIONES II: OBTENCIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES

Las proteínas recombinantes son el resultado de la expresión del ADN recombinante.

La primera que se produjo fue la GH (Hormona del crecimiento o somatostatina), que fue un fracaso comercial, pues tiene un mercado muy limitado. Desde 2005, con costes abaratados, es producida bajo diferentes nombres comerciales por diferentes multinacionales farmaceúticas y compañías biotecnológicas.

Después, se produjo la Insulina en E. coli (Humulina, producida por Genentech, primera empresa biotecnológica, creada en 1976 por Boyer, bioquímico estadounidense que desarrolló en 1973 la clonación molecular de insulina,   comercializada a partir de 1982) La producción industrial de esta hormona fue un éxito, tanto tecno-científico como comercial y sanitario. Gilbert, otro bioquímico estadounidense que compartió Nobel con Sanger en 1980, también fundó una empresa biotecnológica, Biogen, para obtener insulina humana, pero no tuvo tanto éxito.

Otras proteínas recombinantes son:

- Eritropoyetina (EPO)
Estimula la producción de eritrocitos. Es una hormona renal. En 1985, se aisló el gen de la eritropoyetina caracterizándolo para investigación y síntesis. La investigación demostró que el gen codifica la producción de la hormona en las células de los mamíferos. La producción industrial de la eritropoyetina humana recombinante (RhEpo) se iniciaría poco después.

-  Interferón alfa
Proteína antivírica producida por el sistema inmunitario.

- Vacuna contra la hepatitis B
Contiene proteínas víricas producidas por levaduras modificadas genéticamente. Producida desde 1985 .

- Anticuerpos monoclonales, como los que constituyen el fármaco Avastin, producido en Porriño (Pontevedra) para Genentech. Se utiliza como anticancerígeno, principalmente en el caso del cáncer colon-rectal.


- Enzimas utilizados en detergentes (permiten prescindir de los fosfatos, que producen Eutrofización de las aguas).

APLICACIONES: CONSTRUCCIÓN DE GENOTECAS

1. OBTENCIÓN DE GENOTECAS (Genomic libraries)
Una genoteca genómica (ADNg) es un tipo útil de genoteca que contiene fragmentos del ADN genómicos generados mediante la digestión parcial con cantidades limitantes de una enzima de restricción la cual efectúa cortes en determinados sitios con una frecuencia elevada en el genoma. Como consecuencia, se produce una digestión parcial del ADN, de modo que sólo tiene lugar la fragmentación de unos cuantos sitios de restricción, quedando el resto intacto.
Se genera así una colección de fragmentos superpuestos con una longitud idónea para la clonación en un vector de clonación. Tras ligar el vector y el fragmento de ADN, se introduce en una célula hospedadora.
Una genoteca de ADN complementario  (ADNc)es un tipo de genoteca que contiene copias de ADN complementario de la población de ARN mensajero presente en un determinado tejido. Este tipo de genoteca tiene varias ventajas
como que el clon obtenido contiene solamente los exones de un gen, y por lo tanto es una representación directa de la secuencia codificante de un gen, sin los intrones ni otras secuencias promotoras.
La clonación del ADNc se basa en la acción de la transcriptasa inversa, una ADN polimerasa dependiente de ARN derivada de retrovirus. Algunos vectores hábilmente construidos, llamados vectores de expresión, contienen señales de transcripción y de traducción adyacentes al lugar de inserción del ADNc, haciendo posible la transcripción y traducción en bacterias, hongos o células en cultivo, de una molécula de ADNc de longitud completa para poder así producir la proteína que codifica.
Son imprescindibles como paso previo para la secuenciación de genomas. La primera genoteca la hizo Frederick Sanger (dos veces Nobel de Química) como paso previo a la secuenciación del genoma del fago φX174, de 5,3 Kb.

Para detectar las colonias que llevan clonado un determinado gen se realiza Hibridación de colonias puesta de manifiesto por manchas (Colony Blot Hibridation):
 
 

CLONACIÓN MOLECULAR Y TÉCNICAS ASOCIADAS (PCR E HIBRIDACIÓN EN COLONIAS)

TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN DEL ADN

1. HIBRIDACIÓN DEL ADN

Objetivo: localizar el ADN o la colonia que porta el ADN que interesa, p.ej. el gen de la insulina, en el conjunto del ADN celular, para su posterior aislamiento, clonación o manipulación.
Dejamos aquí un PP sobre técnicas de hibridación, entre ellas la de Southern (llamada así por el biólogo molecular de Oxford, Edwin Southern), que aunque tiene aplicaciones para el diagnóstico molecular de enfermedades, la vamos a dejar de lado en este curso para centrarnos en la Hibridación de colonias, por ser ésta un paso esencial en la clonación molecular.



2. SECUENCIACIÓN DEL ADN

 Método de Sanger: 

El inglés Frederick Sanger (uno de los dos únicos científicos que ha conseguido el Nobel dos veces en la misma especialidad, en su caso de Química, en 1958 por obtener la primera secuencia de una proteína, la insulina y otro en 1980 por desarrollar el método Sanger de secuenciación de ADN, que fue de importancia crucial en el PGH) desarrolló un método de secuenciación del ADN basado en didesoxinucleótidos fluorescentes de diferente color (nucleótidos sin el OH-3´).

Este método, comercializado inicialmente por la empresa biotecnológica Applied Systems, fue creado en 1977 y ampliamente utilizado por 40 años. Sin embargo, actualmente está siendo sustituido por los métodos de secuenciación Next-Gen, es decir, de la siguiente generación o de alto rendimiento.

3. AMPLIFICACIÓN DEL ADN: PCR



 

FUNDAMENTOS DE LA PCR de Ingrid Carboney

EJEMPLO DE PREGUNTA DE EBAU:

En la PCR los cebadores son:
a) pequeños fragmentos de ARN que sirven de punto de inicio a la polimerasa.
b) pequeños fragmentos de ADN monocatenario complementarios a una secuencia de ADN que se quiere amplificar y que sirven de punto de inicio a la polimerasa.
c) Proteína que mantienen unidas las hebras para que actúe la polimerasa.

La solución está en el siguiente resumen de esta técnica:

1. Desnaturalización a 98ºC.

2. Hibridación de los cebadores de desoxirribonucleótidos con las secuencias de los extremos 3´de las dos cadenas separadas, al incubarlas a unos 65ºC.

3. Elongación de los cebadores a dicha temperatura, en presencia de ADN pol y dNTP.

4. Amplificación exponencial en sucesivos ciclos.

Animación sobre la PCR 

Termociclador o aparato de la PCR

 

VECTORES DE CLONACIÓN

Un vector de clonación es una molécula de ADN que se utiliza para transferir un gen de un organismo a otro.
Los vectores tienen las siguientes características:
1. Son de pequeño tamaño, para facilitar su manipulación.
2. Tienen un origen de replicación, que les permite replicarse dentro de la célula hospedadora.
3. Contienen marcadores de selección, generalmente genes de resistencia a un antibiótico, que permiten seleccionar las células que lo han incorporado al ser tratadas con el antibiótico.
4. Tienen secuencias diana únicas, para una enzima de restricción.
5. Dichas secuencias están dentro de un gen con función indicadora, como el de la beta-galactosidasa, implicada en el metabolismo de la galactosa, que deja de expresarse al quedar interrumpido cuando se introduce en él el gen clonado, produciéndose un cambio fenotípico.

VECTORES DE CLONACIÓN EN BACTERIAS
1. Plásmidos. Ej. pUC18
 
Es un plásmido muy utilizado, ya que presenta unas características que son muy beneficiosas:
- Es derivado del plásmido pBR322, creado en 1977 en el laboratorio de Herbert Boyer, en California.
- Es pequeño, de modo que puede transportar fragmentos de ADN relativamente grandes (de unos 10.000 pares de bases).
- Tiene un origen de replicación y puede producir hasta 500 copias de los fragmentos de ADN insertado por célula.
- Se ha modificado para que presente muchas secuencias de reconocimiento para enzimas de restricción que se han agrupado en una región denominada polylinker o multiple cloning site (MCS), que está dentro del gen lacZ.
- Permite la identificación sencilla de los plásmidos recombinantes, ya que contiene un fragmento del gen bacteriano lacZ que produce colonias de color azul. Si se inserta un fragmento de ADN en el polylinker, se inactiva el gen lacZ, y da lugar a colonias de color blanco.

2. Fago lambda



 
El genoma del fago lambda se ha cartografiado y secuenciado completamente. Para ser utilizado de vector, el tercio central de su cromosoma puede ser reemplazado por ADN exógeno, sin que ello afecte a la capacidad del fago de infectar células y formar cápsides.
Para clonar ADN utilizando este vector, se purifica el ADN del fago y se corta con una enzima de restricción, con la misma enzima de restricción cortamos el fragmento de ADN de interés y los unimos con una ADN ligasa. Los vectores lambda recombinantes se empaquetan in vitro en las cápsides proteicas del fago, y se introducen en células hospedadoras bacterianas. Dentro de las bacterias, los vectores se replican y forman muchas copias del fago infectivo, llevando todas ellas el fragmento de ADN de interés en la clonación. Los vectores fágicos pueden transportar fragmentos de hasta 20 kb ( kilobases).

3. Cósmidos
Los cósmidos son vectores híbridos utilizando partes del cromosoma de lambda y de plásmidos. Tienen la secuencia cos del fago lambda, necesaria para el empaquetamiento del ADN del fago dentro de su cubierta proteica, además contienen secuencias plasmídicas necesarias para la replicación y genes de resistencia a antibióticos. Los cósmidos pueden transportar casi 50 kb de ADN insertado. 
 
Un cósmido consiste en un plásmido al cual se le han adicionado unos segmentos del genoma de un bacteriófago, el fago λ.
Un cósmido contiene:

• Del plásmido, el ori C y un gen de resistencia a un antibiótico, esto depende del tipo de plásmido del cual derive y, por tanto puede contener más segmentos como por ejemplo el gen LacZ, que permite la selección blanco/azul de las colonias.
• Del fago λ, los extremos COS, extremos complementarios del genoma del fago y que se emplean para la recircularización del mismo.

VECTORES EN CÉLULAS EUCARIÓTICAS

1. EN LEVADURAS: YAC (Yeast Artificial chromosomes)
Los YAC son cromosomas artificiales de levadura. Un YAC tiene telómeros en sus extremos, un origen de replicación y un centrómero. Estos componentes están unidos a genes marcadores de selección y a un grupo de enzimas de restricción para insertar ADN exógeno.
Estos cromosomas artificiales de levadura permiten clonar grandes trozos de ADN, de más de 1000 kb. Muy utilizado en el PGH al principio, por la facilidad para formar genotecas, pero para este uso ha sido sustituido posteriormente por otros vectores más modernos, como otros cromosomas artificiales derivados de ADN bacteriano o vírico.




  
 2. Vectores en células vegetales
Se utiliza mucho el TMV (Virus del Mosaico del tabaco):
  Es un virus de ARN que produce manchas en las hojas del tabaco:




 Otro vector vegetal es el plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens:
 
 
 3. Vectores en células animales
Pueden ser diferentes virus como los retrovirus o el SV40. En humnaos se utilizan los HAC (cromosomas artificiales humanos):

LAS ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN

 ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN o RESTRICTASAS
El Premio Nobel de Medicina de 1978 fue concedido a los microbiólogos  Werner Arber (suizo), y los estadounidenses Daniel Nathans y Hamilton Smith por el descubrimiento de las endonucleasas de restricción lo que condujo al desarrollo de la tecnología de ADN recombinante. El primer uso práctico de su trabajo fue la manipulación de la bacteria E. coli para producir insulina humana para los diabéticos.

Algunas cepas (variedades) de la bacteria E. coli tienen unos sistemas enzimáticos que los protegen del ADN del fago lambda, mediante el corte en regiones interiores del ADN exógeno. Estas secuncias no son cualquier secuencia, sino unas secuencias específicas de entre 4 a 8 pn (pares de nucleótidos).

Las secuencias dianas de restricción son secuencias palindrómicas que pueden dejar los extremos romos o dejarlos cohesivos. Las que hacen esto último son las que tienen interés en Ingeniería Genética, como la enzima EcoRI (enzima de restricción I de E. coli). Los extremos cohesivos de diferente origen (por ejemplo bacteriano y humano) cortados con la misma restrictasa tienden a aparearse espontáneamente, formando moléculas híbridas (de ADN bacteriano y humano, por ejemplo), llamadas moléculas deARN recombinantes.

	Fuente	Secuencia de reconocimiento	Resultado del corte
EcoR1	Escherichia coli	5'GAATTC 3'CTTAAG	5'---G AATTC---3' 3'---CTTAA G---5'

INGENIERÍA GENÉTICA O TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

Es la aplicación de los conocimientos de Genética a la manipulación del ADN y su transferencia a otros organismos.

¿Con qué trabaja la Ingeniería Genética?

La tecnología del ADN recomnbinante utiliza las siguientes herramientas moleculares:

¿Cuáles son las materias primas moleculares?

1. ADN que interesa (por ej. el gen de la GH, hormona del crecimiento).
2. Desoxirribonucleótidos.
3. Oligonucleótidos sintéticos, que permiten fabricar genes, o cebadores para la síntesis o secuenciación de un gen.
4. ARNm del gen, si se utiliza la transcriptasa inversa.

¿Qué enzimas se utilizan?

1. ADN polimerasas.
2. ARN polimerasas, incluida la primasa.
3. Transcriptasa inversa o retrotranscriptasa.
4. Ligasas.
5. Nucleasas, especialmente las Endonucleasas de restricción o restrictasas.

¿Qué son los vectores de clonación y cuáles hay?

Son moléculas en las que se inserta el gen para su posterior introducción en las células hospedadoras, en las cuales se replicará.

Para las células procarióticas hay tres tipos:
1. Plásmidos.
2. Virus bacteriófagos o fagos.
3. Cósmidos (combinación de plásmidos con secuencias víricas que contienen la región cos del fago lambda).

Para las células eucarióticas, depende del tipo de célula:
1. En levaduras (hongos) se usan plásmidos propios de levaduras o YAC (cromosomas artificiales de levaduras). Estos son muy útiles en la construcción de genotecas.
2. En células vegetales se usan el VMT (virus del mosaico del tabaco) y el plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens.
3. En células animales, derivados de ADN viral, de retrovirus, o el virus de simios SV 40.

¿Qué células hospedadoras se utilizan?

La elección de la célula hospedadora depende del producto que se desee obtener, así como de la facilidad de multiplicarla en laboratorio y de desarrollar las técnicas de Ingeniería Genética en ella.

El organismo procariótico más utilizado es Escherichia coli. 
El organismo eucariótico más utilizado es la levadura Saccharomyces cerevisae.

La Tecnología del ADN recombinante es un conjunto de técnicas, como la hibridación para localización de genes, la secuenciación del ADN y la PCR o Reacción en Cadena de la Polimerasa, que permite amplificar exponencialmente una molécula de ADN.
Todas estas técnicas suelen culminar en la Clonación molecular, es decir, en la introducción de un gen de una procedencia en un segmento de ADN de diferente procedencia, y la obtención de numerosas células con ese gen introducido (el gen clonado).


Las aplicaciones son numerosas:

1. Creación de genotecas (genetic libraries) para:
   1.1. Aislamiento de genes.

   1.2.  Conservación de genomas de interés: restos arqueológicos (momias, ...), especies en extinción (genoma del Soledon dominicano, mamífero venenoso que sobrevivió al meteorito de Yucatán), individuos con enfermedades raras (El ADN del falso humanoide (ET) enano de Atacama)

   1.3. Secuenciación de genomas. Línea temporal de especies con los genomas secuenciados. El primer genoma de ADN secuenciado fue el del fago phiX-174, con una molécula de ADN circular de una cadena de 3,4 kb, en 1977, por el equipo de Sanger, con el método manual que él había desarrollado (método de Sanger).

 Habría que esperar 17 años(hasta 1995) para la secuenciación del primer genoma de un organismo celular: Haemophilus influenzae, bacilo que produce meningitis, con 1.800 kb (1,8 Mb). En el mismo año se secuenció otro genoma procariótico, esta vez de una arquea (una especie de metanógena termófila, Methanococcus). 

En 1996 se secuenció el primer genoma eucariótico, el de la levadura cervecera, con 12,1 Mb y n= 32 cromosomas. En 2001 se publicó la secuencia de 3.200 Mb (3,2 Gb) del genoma humano, con n=23 (más el cromosoma Y). Sin embargo, faltaba el 8% del gnoma humano, que se ha publicado el 31 de marzo de 2022 en la revista Science : https://www.dw.com/es/cient%C3%ADficos-descifran-finalmente-el-mapa-de-todo-el-genoma-humano-revelando-regiones-ocultas/a-61333578

Un año antes que el humano se secuenciaron otros tres genomas eucarióticos: uno de una planta cosmopolita, Arabidopsis thaliana, y dos de animales modelo, el nemátodo Caenorhabditis elegans y la mosca del vinagre. Desde entonces, al haberse acelerado mucho el proceso, con la PCR y la bioinformática, se han secuenciado y comparado multitud de genomas, incluidos genomas fósiles, como los de los neandertales y los denisovanos (subespecie presapiens que vivió en Asia Central y se hibridó con los sapines cuando estos llegaron allí).

2. Obtención de microorganismos recombinantes: E. coli productora de insulina, GH,...

3. Obtención de plantas o animales transgénicos (OGM: organismos genéticamente modificados) como el arroz dorado o los peces-cebra fluorescentes. Entre las numerosas aplicaciones están:

•  3.1. Investigación: para descubrir las funciones de ciertos genes. Una manera   de lograrlo es mediante la técnica Knockout de bloqueo de genes y observando el fenotipo resultante. Otra estrategia es unir el gen a un promotor muy activo y ver qué ocurre cuando se sobreexpresa. Se ha utilizado mucho para crear modelos animales para investigación de enfermedades humanas, como el cáncer. Muchos de los animales manipulados llevan insertado el gen de la GFP (Proteína Fluorescente Verde) procedente de una medusa, por lo que sus descubridores fueron premiados con el Nobel de Química en 2008, ya que esto facilita la visualización de la expresión de otras proteínas.
• 3.2 Fabricación de productos terapéuticos: insulina fabricada por bacterias con el gen dela insulina humana insertado en su cromosoma, levaduras modificadas que producen un Ag presente en la vacuna de la hepatitis B, etc.
• 3.3. Terapia génica: utiliza virus genéticamente modificados que introducen genes en embriones u organismos con genes mutantes. Se ha utilizado con un éxito relativo en el tratamiento de niños con inmunodeficiencia hereditaria combinada grave (generalmente ligada al cromosoma X o al 20). La terapia génica de células germinales es un tema muy controvertido, prohibido en algunas legislaciones, por sus efectos eugenésicos (mejora del pool génico de una población). En España está prohibida explícitamente la terapia génica de células germinales que no esté encaminada a curar una enfermedad genética grave: Legislación en España. Actualmente, la terapia génica hace más uso de la edición génica mediante la técnica CRISPR (cuyos fundamentos se deben al español Francis Mójica) que de la tecnología del ADN recombinante (ingeniería genética clásica). Noticias sobre terapia génica en elpais.com. En 2018 un cientifico chino logro obtener bebes modificados geneticamente mediante CRISPR.
• 3.4 Animales de compañía: creación de perros y gatos hipoalergénicos o de peces-cebra flourescentes.
• 3.5 Producción industrial : se creó la patata amflora, rica en amilopectina, para fabricar papel, pero una serie de cuestiones ambientales (que llevaba un gen de resistencia  a antibióticos y esto podría generar resistencia  a antibióticos en bacterias, la presencia de una variedad transgénica ilegal , la amadea, etc.) la hicieron fracasar.
• 3.6 Resistencia a plagas y herbicidas: los principales son las variedades de maíz y soja transgénicos RR (Roundup Ready) resistentes al herbicida glifosfato, que así mata a las malas hierbas, pero no al maíz o la soja. En 2007, científicos sudafricanos crearon una variedad de maiz resistente a un virus, habiéndose obtenido posteriormente híbridos de ambos resistentes, al herbicida y a la plaga vírica.
• 3.7 Alimentos mejorados o más eficientes: un ejemplo es el arroz dorado, que contiene caroteno (pro-vitamina A), recomendable para las poblaciones pobres de la India y SE asiático con alimentación basada en el arroz (dieta hipovitamínica). Sin embargo, el arroz dorado no se libra de la polémica que rodea a todos los alimentos transgénicos.
• 3.8 Control de plagas: un ejemplo es un mosquito (Aedes aegypti) que puede portar el virus del dengue. Se ha logrado introducir en estos mosquitos un gen letal, habiéndose reducido sus poblaciones en algunos casos hasta el 80%. 

 4. Realización de estudios forenses y de paternidad o parentesco, de las migraciones humanas, ...

5. Diagnóstico de enfermedades genéticas y víricas (PCR).

La era del ADN recombinante comenzó en 1973 cuando los científicos estadounidenses Boyer y Cohen consiguieron clonar un gen foráneo de resistencia a un antibiótico a E. coli, a lo que siguió  la clonación de la GH humana y de la insulina humana en la misma bacteria.

*químico británico con dos premios Nobel de Química (única persona en el mundo, tres más han recibido dos premios Nobel.

EVIDENCIAS O PRUEBAS DE LA EVOLUCIÓN

1. PRUEBAS PALEONTOLÓGICAS

Se observa en el registro fósil un aumento progresivo de la complejidad de los organismos, así como un aumento de la biodiversidad, interrumpido por 5 extinciones masivas (la última fue hace 65 Ma, en la que se extinguieron los dinosaurios no alados, hoy estamos en la 6ª gran extinción por la acción humana).

   1.1. FORMAS INTERMEDIAS. Ej.1. Archaeopteryx  Forma intermedia,  de 150 Ma, entre los dinosaurios y las aves, descubierta en 1861 en las calizas litográficas de Solnhofen (Baviera), apoyando la teoría de Darwin, publicada dos años antes.











Ej.2. Australopithecus, forma intermedia entre los primates no humanos como los ardipitecos y los humanos:

 
Cráneo de A. afarensis. Este género, que vivió entre 4 y 2 Ma en África, fue establecido en 1925(Darwin publicó El Origen del Hombre en 1871). Este era el "eslabón perdido" que pedían los anti-evolucionistas y que Dart encontró.

Hoy día se han encontrado muchos eslabones entre los simios de hace 7 Ma y nosotros:

Los Simpson y los eslabones perdidos (vídeo)

   1.2. SERIES FILOGENÉTICAS.

Ej. Los équidos:
 
 

Otro ejemplo sería el mostrado anteriormente de los homínidos, pero realmente el concepto de serie filogenética como algo lineal y progresivo ha sido superado por los árboles filogenéticos, donde ramas separadas pueden incluso volver a encontrarse como pasó entre los sapiens que al salir de África se encontraron con los denisovanos en Asia y con los neandertales en Europa y Asia, de modo que actualmente los europeos llevamos como un 2% de ADN neandertal. También los habitantes de las islas de Andaman (India) y los aetas de las islas Filipinas llevan algo de ADN de alguna especie pre-sapiens.

2. PRUEBAS BIOGEOGRÁFICAS

Ya en el siglo XVII Rayleigh argumentó que la fauna americana no podía haber sido salvada en el Arca de Noé y que habría "evolucionado" a partir de las especies salvadas en el arca, tras alcanzar el continente americano, adaptarse a él y diversificarse.

Estas pruebas se basan en que cuanto más alejadas y separadas están dos zonas, más diferentes son su flora y su fauna, como pasa con la fauna australiana, que debido a la tectónica de placas, se separó antes del Pangea que los demás continentes (hace unos 200 Ma), quedando aislada desde entonces. Razón por la cual solo encontramos mamíferos monotremas en Australia (el ornitorrinco) y Nueva Zelanda (el equidna) y casi todas las especies marsupiales (canguros, koalas, etc.) en Australia. Los mamíferos placentarios surgieron después del aislamiento geológico de Australia, por lo que no forman parte de la fauna autóctona australiana.
 

 

Pinzones de Darwin, adaptados a las diferentes islas Galápagos y a diferentes tipos de alimentación. Pertenecen a una familia de pájaros americanos (Traúpidos, con 236 especies, de las que 14 viven en las Galápagos).
Los pinzones de Darwin muestran la evolución en directo (ABC, 2016) 

3. PRUEBAS EMBRIOLÓGICAS

Las hendiduras branquiales se siguen observando en los primeros estados embrionarios de todos los vertebrados. Haeckel, biólogo alemán que defendió la teoría de Darwin, estableció su Ley Biogenética: "La ontogenia recapitula la filogenia" (el desarrollo de un individuo recapitula las fases del desarrollo evolutivo de la especie). Aunque no es totalmente cierto, sí lo es que grupos emparentados comparten formas embrionarias o larvarias muy parecidas, como ocurre con la larva trocófora de Anélidos y Moluscos, mostrando un origen común:



4. PRUEBAS ANATÓMICAS

   4.1. ÓRGANOS HOMÓLOGOS. Tienen diferente forma externa pero la misma estructura interna , como ocurre con las extremidades de los vertebrados tetrápodos:


Son consecuencia de una divergencia o radiación adaptativa: las diferentes familias de una misma clase (por ejemplo, los mamíferos) han divergido por adaptación a diferentes ambientes :

Todos los mamíferos proceden de mamíferos mesozoicos parecidos a las musarañas, por adaptación a los diferentes ambientes que quedaron libres tras la extinción de los dinosaurios (65 Ma).

4.2. ÓRGANOS ANÁLOGOS
Tienen una forma externa parecida pero estructura interna totalmente diferente.
Son resultado de una convergencia adaptativa, que aunque no permite establecer relaciones de parentesco evolutivo, sí muestran que las especies adoptan soluciones parecidas para adaptarse al mismo ambiente.


4.3. ÓRGANOS VESTIGIALES
 
En el ser humano, el apéndice vermiforme podría tratarse de un órgano vestigial o atavismo de cuando nuestros antepasados eran más herbívoros (esta interpretación es controvertida, pues actualmente se tiende a pensar que no es un órgano vestigial, sino que tiene una función inmunológica). También la muela del juicio o 3º molar es un vestigio de cuando nuestros antepasados homínidos tenían mandíbulas mayores, con suficiente espacio para este 3º molar, que ayudaba en la masticación de una dieta más herbívora. Actualmente, la mandíbula menor hace que frecuentemente no haya espacio suficiente para un correcto desarrollo de esta muela y haya que extirparla. Por último, el pelo corporal es otro vestigio de nuestros antepasados.

 

 Lucy (Australopithecus)

 Homo erectus    

     

5. PRUEBAS BIOQUÍMICAS 

La comparación de las secuencias de aa de las proteínas o de nucleótidos del ADN de especies emparentadas, permite calibrar un reloj molecular:

 

   Además de establecer relaciones de parentesco, las pruebas bioquímicas, como que todos los seres vivos comparten los mismos tipos de moléculas, que tienen prácticamente el mismo código genético, y que sus rutas metabólicas son casi idénticas, han puesto de manifiesto, sin lugar a dudas, que todos los seres vivos proceden de un antepasado común: LUCA.
LUCA: Last Universal Common Ancestor. 

Resumiendo, un par de pruebas de cada tipo:

1. Paleontológicas: formas intermedias ("eslabones perdidos y encontrados") como el Archaeopteryx y series filogenéticas, como la del caballo.

2. Biogeográficas: fauna de mamíferos australiana y pinzones de Darwin.

3. Embriológicas: embriones de vertebrados y larvas de invertebrados.

4. Anatómicas: órganos homólogos vs análogos y órganos vestigiales.

5. Bioquímicas: secuencias de ADN y de proteínas (más parecidas cuanto más emparentadas evolutivamente están dos especies) y código genético (cuasi)universal.