TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN DEL ADN

1. HIBRIDACIÓN DEL ADN

Objetivo: localizar el ADN o la colonia que porta el ADN que interesa, p.ej. el gen de la insulina, en el conjunto del ADN celular, para su posterior aislamiento, clonación o manipulación.
Dejamos aquí un PP sobre técnicas de hibridación, entre ellas la de Southern (llamada así por el biólogo molecular de Oxford, Edwin Southern), que aunque tiene aplicaciones para el diagnóstico molecular de enfermedades, la vamos a dejar de lado en este curso para centrarnos en la Hibridación de colonias, por ser ésta un paso esencial en la clonación molecular.



2. SECUENCIACIÓN DEL ADN

 Método de Sanger: 

El inglés Frederick Sanger (uno de los dos únicos científicos que ha conseguido el Nobel dos veces en la misma especialidad, en su caso de Química, en 1958 por obtener la primera secuencia de una proteína, la insulina y otro en 1980 por desarrollar el método Sanger de secuenciación de ADN, que fue de importancia crucial en el PGH) desarrolló un método de secuenciación del ADN basado en didesoxinucleótidos fluorescentes de diferente color (nucleótidos sin el OH-3´).

Este método, comercializado inicialmente por la empresa biotecnológica Applied Systems, fue creado en 1977 y ampliamente utilizado por 40 años. Sin embargo, actualmente está siendo sustituido por los métodos de secuenciación Next-Gen, es decir, de la siguiente generación o de alto rendimiento.

3. AMPLIFICACIÓN DEL ADN: PCR



 

FUNDAMENTOS DE LA PCR de Ingrid Carboney

EJEMPLO DE PREGUNTA DE EBAU:

En la PCR los cebadores son:
a) pequeños fragmentos de ARN que sirven de punto de inicio a la polimerasa.
b) pequeños fragmentos de ADN monocatenario complementarios a una secuencia de ADN que se quiere amplificar y que sirven de punto de inicio a la polimerasa.
c) Proteína que mantienen unidas las hebras para que actúe la polimerasa.

La solución está en el siguiente resumen de esta técnica:

1. Desnaturalización a 98ºC.

2. Hibridación de los cebadores de desoxirribonucleótidos con las secuencias de los extremos 3´de las dos cadenas separadas, al incubarlas a unos 65ºC.

3. Elongación de los cebadores a dicha temperatura, en presencia de ADN pol y dNTP.

4. Amplificación exponencial en sucesivos ciclos.

Animación sobre la PCR 

Termociclador o aparato de la PCR